FARIMAL: Nouvelle méthodologie pour la détermination de l’espèce des produits d’origine animale dans les aliments pour bétail : couplage des techniques micro-spectroscopiques et de la PCR en temps réel

FARIMAL: Nouvelle méthodologie pour la détermination de l’espèce des produits d’origine animale dans les aliments pour bétail : couplage des techniques micro-spectroscopiques et de la PCR en temps réel

Projet CRA-W/SPF, coordinateur


Contexte

Depuis l’émergence de l’épidémie de l’Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB), la législation européenne portant sur l’utilisation des sous-produits d’origine animale dans l’alimentation à destination de l’élevage restreint fortement le recours aux protéines dérivées de tissus animaux. D'autre part, elle impose le développement de méthodes qui permettent la détection des farines animales au niveau des espèces ou de groupes d’espèces tels que les ruminants (Règlements européens 999/2001, 1774/2002 et 1234/2003). Si, à l’heure actuelle, la microscopie classique est la seule méthode officielle pour la détection de constituants d’origine animale dans l’alimentation du bétail, la technique montre ses limites quant à la classification taxonomique des particules animales. De plus, la microscopie repose essentiellement sur la détection et l'identification de fragments d’os alors que la détection et l'identification de particules de muscle ou de tout autre tissu animal est essentielle pour la mise en place d'un contrôle adéquat.

Des résultats obtenus au sein du CRA-W dans de précédents projets nationaux (Projet RCS N° S‑6112 - "Détection et quantification des farines d'origine animale dans les aliments pour bétail") et européens (http://stratfeed.cra.wallonie.be) démontrent le potentiel de techniques micro-spectroscopiques (microscope dans le proche infrarouge - NIRM et caméra NIR) ainsi que de la technique PCR en temps réel. Ce projet vise donc à développer une méthodologie innovante en combinant les avantages des deux méthodologies et en répondant complètement aux exigences de la législation, à savoir la détection et l’identification de l’espèce animale d’origine à de faibles niveaux (à partir de 0,1% en poids) de particules animales issues de différents tissus (os, muscle, …).

Objectifs

Les techniques micro-spectroscopiques (microscope NIR et caméra NIR) permettent la détection ciblée de particules d’os et de muscles. Elles présentent le gros avantage d’avoir un caractère non destructif permettant donc un autre type d’ analyse sur l’objet d’étude. La PCR met en évidence une source d’ADN d’origine animale, même à de très faibles teneurs, mais est influencée par la présence de constituants autorisés tels que le lait en poudre, les ovoproduits et le sang ainsi que par des graisses. Par contre, la PCR est actuellement la seule technique à pouvoir déterminer l’espèce animale présente dans l’échantillon. La stratégie envisagée est donc : 1) de localiser les particules d’os et de muscles par micro-spectroscopie et de les isoler 2) de transférer chacune d’elles dans un puits d’une plaque PCR 3) d’en analyser l’ADN par PCR pour 4) déterminer son espèce d’origine. Le présent projet a également pour objectif d’évaluer le potentiel de deux autres techniques spectroscopiques à savoir la spectroscopie Raman et la fluorescence.

Description des tâches

Concrètement, le CRA-W est impliqué dans les tâches suivantes: 1.Optimiser la détection des particules de viande et d’os par NIRM et Caméra NIR. 2.Développer des modèles de prédiction basés sur les données spectrales NIR permettant de déterminer l’origine des particules jusqu’à l’espèce. 3.Développer un protocole permettant le transfert des particules de l’analyse par les techniques spectroscopiques vers la PCR. 4.Développer un protocole de PCR en temps réel permettant l’analyse de particules prises individuellement et la détermination de leur origine jusqu’à l’espèce.

Résultats attendus

Grâce à cette nouvelle méthodologie, il devrait être possible de détecter la présence de protéines d’origine animale issues de farines de muscles et d’os et de déterminer leur origine génétique jusqu’à l’espèce indépendamment d’autres produits animaux autorisés (graisses et poudres de lait).

Résultats obtenus

Un nouveau protocole d’extraction de l’ADN a été développé. Il utilise un tampon d’extraction particulier permettant de réaliser 5 PCR avec l’extrait d’une seule particule. Un protocole  de nettoyage de la particule efficace, c’est-à-dire  garantissant une amplification de l’ADN  interne à la particule, doit encore être optimisé.Des bases de données spectrales spécifiques des principales espèces utilisées dans la fabrication des farines animales ont été construites et des modèles de discrimination entre particules de ces espèces ont été développés. Des marqueurs spectraux (des bandes spectrales caractéristiques) spécifiques des poissons, du bœuf, du porc et des volailles ont été identifiés.La spectrométrie Raman a démontré son potentiel pour l’analyse des sédiments avec des longueurs d’ondes discriminantes à 960 cm-1 et 1087 cm-1.Une étude portant sur un nombre limité d’échantillons a également permis de montrer que l’analyse d’échantillons par fluorescence pouvait apporter des informations sur la présence de farines animales.Ces recherches seront poursuivies dans le cadre du projet européen SAFEED-PAP. .

Contribution

Le CRA-W apporte son expertise dans le développement des méthodes spectroscopiques et de biologie moléculaire.

Publications

  • Abbas, O. , Dardenne, P. , Baeten, V. & Fernández Pierna, J.A. (2009). A NIRM system running under accreditation ISO 17025 for the detection of processed by-products of animal origin. Poster in: 3rd International Feed Safety Conference 2009: Methods and Challenges, Wageningen - The Netherlands, 6-7 October 2009.
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  • Fumière, O. , Berben, G. , Marien, A. , Baeten, V. & Fernández Pierna, J. (2007). Nouvelle méthodologie pour la détermination de l'espèce des produits d'origine animale dans les aliments pour bétail: couplage des techniques micro-spectroscopiques et de la PCR en temps réel.rapport annuel SPF - Farimal, 53 p.
  • Fumière, O. , Marien, A. , Berben, G. , Baeten, V. & Fernández Pierna, J.A. (2007). Original combination of real time PCR and NIRM for the detection and the speciation of animal particles. CRA-W. Proceedings in: FEED SAFETY International Conference 2007: Methods and Challenges, Namur - Belgique, 27-28/11/2007, 66-67.
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Coordinateur (CRA-W)

Equipe impliquée

Partenaires

JRC-IRMM: Dr Christoph von Holst et Dr Ana Boix; AFSCA: Ir Jeroen Van Cutsem; UCL: Prof. Marc Meurens