Développement de technologies de culture in vitro pour la création de diversité génétique.

Contexte

La base génétique des ligneux fruitiers est restreinte. Pour renouveler et diversifier les variétés ainsi qu’intégrer de nouveaux caractères agronomiques, on recherche des technologies accélérant les processus d’amélioration classique. Certaines cultures de tissus in vitro offrent les possibilités de modifier le génotype à haute fréquence, dans un laps de temps relativement court et sans nécessairement impliquer de changements profonds ou irréversibles. Elles constituent en outre des alternatives potentielles à la transformation génétique lorsqu’associées aux techniques de marquage moléculaire.
La transformation génétique requiert des systèmes de régénération performants et fiables surtout du point de vue de la stabilité d’expression des gènes d’intérêt. A ce jour, les orientations suivantes sont développées :
- Utilisation de la variation somaclonale pour modifier la couleur des fruits et le port des arbres.
- Transformation avec A. rhizogenes en vue de créer des porte-greffes de Prunus influençant la physiologie des arbres : aptitude au bouturage, port, floraison.
- Recherches sur la compétence à la régénération et sur la variation génétique induite in vitro chez les arbres fruitiers.
- Construction de chimères stables pour améliorer la tolérance aux maladies et contrôler la croissance des arbres fruitiers.
Les techniques intervenant dans les études sont :
le bourgeonnement adventif, le multi-apexing sur méristème, l’embryogenèse somatique, la culture de protoplastes

Objectifs

- Couleur des fruits à pépins et port des arbres par variation somaclonale.

Des mutations relatives à la couleur des fruits et au port des arbres fruitiers apparaissent naturellement dans les vergers de manière aléatoire.
Le bourgeonnement adventif induit in vitro accentue la fréquence, et élargit la gamme de variations du fruit à d’autres caractéristiques telles que la forme, la fermeté ou le temps de maturation qui s’avèrent stables.
Les régénérants triés précocement in vitro sont transférés en verger par microgreffage. Les premiers fruits s’observent 4 à 5 ans après la première manipulation in vitro. Une extension est prévue au poirier avec la variété Doyenné du Comice.
Des régénérants de Boskoop sont observés quant au caractère « spur » des rameaux.

- Porte-greffe de Prunus exprimant les gènes "rol" d'A. rhizogenèse

L’accroissement du volume du système racinaire ainsi que l’accentuation du branchement latéral et de la floraison conférés à certaines plantes contaminées par A. rhizogenes sont des propriétés recherchées en culture fruitière comme en foresterie.

Les premiers essais ont conduit à la régénération de divers clones du porte-greffe nanisant de cerisier « Inmil » (P. incisa x serrula) au travers de processus successifs de rhyzogenèse, d’embryogenèse somatique et de bourgeonnement adventif.
Ces arbres présentent un problème de survie en conditions de croissance contrôlée de serre.
Les expériences sont répétées avec P. avium après bourgeonnement sur racines transformées.

- Etude de pommiers aneuploïdes

Les aneuploïdes constituent une source de diversité génétique pour plusieurs espèces fruitières. Les croisements de pommier entre Jonagold et McIntosh ‘Wijcik’ (port colonnaire) ne sont pas viables sur leurs propres racines. Toutefois, le microgreffage de semis réalisés in vitro conduit à des plants fructifères et fertiles.
Des analyses moléculaires de types AFLP et micro-satellites pratiquées sur la F2 d’un aneuploïde H48 indiquent que celle-ci résulte d’hybridations classiques.
De la variabilité génétique apparaît au cours du processus de bourgeonnement adventif de certains aneuploïdes. Les différences détectées par cytométrie en flux sont quantitativement très faibles ou de nature polyploïdique.
Les clones régénérés et les descendants d’aneuploïdes sont observés au verger sur base du port colonnaire.

- De la compétence à la régénération

Chez les ligneux fruitiers, la régénération de plantes entières constitue le principal facteur limitant l’application des biotechnologies. Les techniques nécessitent une optimisation continue. La compétence cellulaire à la régénération est étudiée pour mieux contrôler l’origine des bourgeons et des embryons somatiques.
Le mutli-apexing pratiqué sur dôme méristématique (0.1mm) implique un minimum de cellules dans la néoformation de bourgeons et diminue en conséquence le risque de régénérer des chimères.
L’origine unicellulaire du régénérant constitue l’objectif ultime. Il peut être atteint par l’embryogenèse somatique ou la culture de protoplastes. Chez Prunus, l’embryogenèse somatique est limitée à quelques génotypes seulement. La transmission génétique de cette propriété a été vérifiée chez ‘Inmil’ ; l’étude se poursuit. De même, les moyens d’étendre la culture de protoplastes réussie avec le même Prunus incisa x serrula (des protoclones croissent au verger) à d’autres Prunus doivent être recherchés en fonction de l’avancement des connaissances dans ce domaine.
Une combinaison de systèmes de régénération devrait conduire à la construction de chimères.