Développement d'outils rapides de détection et d'identification de bactéries phytopathogènes

Contexte

Ce projet s'inscrit dans le contexte scientifique du projet "Meilleure connaissance des bactérioses et des sensibilités variétales en vue d'une lutte raisonnée en horticulture fruitière" également exposé sur ce site internet. Les bactéries pathogènes rencontrées en Wallonie (sud de la Belgique) posent donc problème en ce qui concerne leur identification et la lutte pour les contrôler. Un diagnostic correct, précis et rapide des maladies bactérienne, et le développement de moyens de lutte alternatifs à l'utilisation du cuivre, seraient des gages d'efficacité et de qualité pour l'agriculture wallonne.
L'étude des métabolites secondaires produits par les bactéries pathogènes apporte une aide à ces deux niveaux. Un métabolite secondaire est une molécule qui n'est pas indispensable à la survie d'un organisme mais qui est pourtant produite par cet organisme. La conservation des mécanismes moléculaires parfois très complexes qui mènent à leur production laisse présumer de l'intérêt de ces molécules pour les souches productrices.
En ce qui concerne la problématique de l'identification des bactéries pathogènes, une identification réalisée par les voies traditionnelles est souvent longue. Des tests de pathogénicité peuvent être utilisés, mais ils sont difficiles à mettre en oeuvre de façon systématique. La recherche de moyens rapides d'identification via la détection par des tests immunologiques ou génétiques de caractères spécifiques aux pathogènes est donc justifiée. Parmi les caractères spécifiques utilisables, la relative spécificité de la production de certains métabolites secondaires en fait des outils de choix pour typer, identifier ou classifier des bactéries. Des métabolites secondaires particulièrement intéressant en raison des avantages adaptatifs évidents qu'ils confèrent aux souches productrices sont les phytotoxines, qui sont des facteurs accentuant la virulence, et les sidérophores, indispensables à la fixation du fer.
En ce qui concerne la problématique de la lutte contre les bactéries pathogènes, des moyens de lutte alternatifs envisageables sont la lutte biologique ou l'amélioration de la résistance variétale, mais, dans les deux cas, il s'agit de problématiques complexes qui nécessitent préalablement une bonne connaissance de la diversité interne au sein des espèces, cela afin de développer des méthodes de lutte qui auront une chance d'être efficaces contre le plus grand nombre d'organismes nuisibles. Il importe donc de disposer d'une bonne connaissance de l'écologie des souches et de leurs éventuels avantages adaptatifs les unes par rapport aux autres et par rapport au reste de la microflore colonisant la surface des végétaux. Il semble donc intéressant de caractériser les souches en ce qui concerne les métabolites qu'elles sont capables de produire si l'on veut connaître les avantages adaptatifs de ces souches.

Objectifs

Etudier la diversité des métabolites secondaires ayant un intérêt adaptatif produits par les bactéries pathogènes et déterminer leurs spécificités de production, cela en vue d'une meilleure caractérisation des souches (en vue de la recherche ultérieure de nouveaux moyens de lutte) et du développement de nouvelles techniques d'identification.

Résultats obtenus

La production de lipodepsipeptides toxiques produits par les pathovars syringae, aptata et atrofaciens au sein de l'espèce Pseudomonas syringae a été étudiée. Ces travaux ont mené au développement de tests d'identification portant sur la détection de l'effet biologique des toxines produites (Fig. 1A) ou sur la détection par un test génétique de polymérisation en chaîne (PCR) d'un gène intervenant dans la sécrétion de ces toxines large spectre (Fig. 1B).
Les analyses menées dans notre laboratoire ont indiqués que la pyoverdine fluorescente produite par Pseudomonas syringae (Fig. 2A) était atypique. En effet, liée au fer, ses caractéristiques visuelles et d'absorbtion varient avec le pH (Fig. 2B).Une analyse par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) de la production de pyoverdines a été réalisée parmi les différentes espèces de Pseudomonas fluorescents phytopathogènes. Cette étude a mis en évidence l'intérêt des pyoverdines en identification, mais également en systématique. De nouvelles pyoverdines et dihydropyoverdine ont été purifiées et caractérisées par analyse d'acides aminés et par spectrométrie de masse. L'étude a démontré la conservation d'une même pyoverdine atypique dans plus de 40 pathovars de Pseudomonas syringae et dans les espèces apparentées Pseudomonas viridiflava et Pseudomonas ficuserectae. L'espèce proche Pseudomonas chicorii produit une pyoverdine atypique très similaire mais différente. Les espèces plus éloignées Pseudomonas asplenii et Pseudomonas fuscovaginae produisent une pyoverdine atypique dont la structure commune est cette fois plus différente de celle de Pseudomonas syringae. Toutes les espèces de Pseudomonas fluorescents phytopathogènes plus éloignées, dont Pseudomonas marginalis, et les espèces de Pseudomonas fluorescents saprophytes produisent par contre des pyoverdines typiques. Des tests d'identification visuels (Fig. 2B), par spectrophotométrie, par isoélectrofocalisation et par HPLC, basés sur ces caractéristiques, ont été développés.
La yersiniabactin est un sidérophore produit par diverses bactéries entériques pathogènes de l’homme, dont Yersinia pestis, l’agent de la peste bubonique. La production de yersiniabactin par certains pathovars de Pseudomonas syringae a été récemment établie au laboratoire.

Partenaires

Professeur H. Budzikiewicz et Dr. M. Schäfer, Institut de Chimie Organique, Université de Cologne, Allemagne
Professeur E. de Hoffmann, Laboratoire de Spectrométrie de Masse, Université catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve
Professeur H. Maraite, Unité de Phytopathologie, Université catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve
Professeur B. Wathelet, Unité de Chimie Biologique et Industrielle, Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques de Gembloux