A l’exception de rares développements pratiques, concrétisés par la commercialisation de variétés transgéniques, les avantages de la manipulation génétique des végétaux sont la disponibilité d’outils additionnels et de nouvelles voies de compréhension en recherche de base. Les précieuses informations acquises par ce biais concernent de nombreux processus fondamentaux, tels que les bases moléculaires de l’interaction plante-pathogène, la physiologie de la résistance aux stress, la régulation de l’expression de gènes impliqués dans le contrôle qualitatif et quantitatif de la valeur nutritionnelle des aliments. La régénération de plantes in vitro au départ de tissus transformés et sélectionnés est généralement une condition requise pour l’ingénierie génétique des végétaux. En tant que l’une des espèces alimentaires les plus importantes, le blé fut de ce point de vue intensivement étudié. Différents organes furent évalués pour l'induction de cultures régénérables: pousses feuillées, inflorescences immatures, anthères, microspores isolées et embryons immatures. Les embryons immatures sont considérés comme la meilleure source de tissus et représentent jusqu'ici le matériel de choix pour la manipulation génétique du blé. Les embryons immatures ou les cals initiés de ces derniers constituent les tissus-cibles pour l’introduction d’ADN par méthode de transfert directe ou via Agrobacterium. Les plantes transgéniques sont générées par embryogenèse somatique au sein des tissus transformés. Cependant les embryons immatures ne peuvent être récoltés au champ que pendant une courte période de l’année, ou les plantes donneuses doivent être cultivées en conditions contrôlées, ce qui requiert des ressources supplémentaires. En outre, les conditions de croissance des plantes-sources affectent la compétence des embryons à la régénération et à la transformation. En conséquence, la production de quantités substantielles d’embryons immatures de qualité et au stade physiologique adéquats est laborieuse et contraignante. Pour éviter ces inconvénients, nous proposons une méthode de transformation alternative par l’application de la technologie de bombardement de particules à des cals dérivés de la culture d’embryons zygotiques matures. A la différence de leurs équivalents immatures, ils sont disponibles en quantités tout au long de l’année, facilement stockés sous la forme de graines déshydratées, et ce matériel présente une moindre variabilité physiologique.
Objectifs
L'objectif initial de ce projet était de développer un procédé de transformation simple et fonctionnel applicable aux embryons matures réduits en fragments par broyage. Ces fragments (diamètre moyen 500µm) sont déposés sur milieu nutritif semi-solide pour produire des cals embryogènes, tissus-cibles pour l’introduction d’ADN par bombardement. Notre mission principale est d’apprécier si les cals engendrés de la culture d’embryons matures fragmentés constituent un matériel propice à la production de tissus transformés, desquels des plantes transgéniques pourraient être générées. Autour de cet objectif principal s’articulent des études complémentaires: 1. L’incidence de la composition du milieu de culture en régulateurs de croissance sur la réponse morphogénétique des fragments de tissus. 2. Le développement d’une méthode de régénération et l'évaluation de ses performances. 3. La réceptivité des cals bombardés à la pénétration des particules et, en conséquence, la vérification de leur compétence à la régénération en dépit des lésions mécaniques qu’ils ont subies. 4. La détermination de la durée optimale de culture des tissus préalable à leur bombardement et concurremment la pertinence de leur sélection. 5. La démonstration de l’aptitude à la transformation des cals initiés d’embryons matures.
Résultats attendus
Nous avons élaboré une méthode efficace de transformation basée sur la culture d’embryons matures. Des études supplémentaires sont requises pour déterminer si les variations de réceptivité de tissu révélées dans ce travail sont à attribuer à leur intensité de prolifération cellulaire, à leur état physiologique, ou à des différences du niveau de méthylation d'ADN et de ses fluctuations pendant la culture de tissu. La compréhension des déterminants biologiques de la différence d’aptitude à la transformation et au « silencing » des transgènes seraient d'intérêt considérable pour tout travail de manipulation génétique des végétaux.
Résultats obtenus
1. Nous avons démontré que les cals dérivés de fragments d’embryons matures présentent une bonne compétence à la régénération. Le meilleur taux de formation de structures de type embryogène est observé lorsque le 2,4-D (2 mg/l) est supprimé après une période d’induction de 3 à 4 semaines. 2. La meilleure fréquence de régénération acquise selon notre protocole (25 à 30 plantes pour 100 embryons) est comparable, voire supérieure, aux résultats renseignés lors de la culture d’embryons immatures. 3. La mesure de la capacité des cals bombardés à produire des tissus embryogènes et à engendrer des plantules nous permet de confirmer que ceux-ci préservent leurs potentiels embryogènes et de régénération après bombardement. 4. L’état physiologique le plus favorable pour l’introduction de l’ADN et l’expression du transgène (gus) dans les cals initiés d’embryons matures est conféré par une préculture de 6 jours. La plus forte activité GUS est enregistrée lorsque les cals sont soumis à une pression de sélection. 5. Pour valider la technique proposée, la compétence à la transformation des cals initiés d’embryons matures fut démontrée et comparée à celle de cals dérivés d’embryons immatures, utilisés comme référence. Des études d’expression GUS à long terme (1 à 7 semaines postérieures au bombardement) révèlent des comportements distincts entre les tissus. Il est intéressant de souligner que, comparés aux cals issus des embryons immatures, ceux produits selon notre protocole présentent un plus grand nombre de cellules exprimant le transgène de manière stable. Pour autant que ces cellules transformées de manière stable engendrent des secteurs susceptibles de générer des plantules exprimant le transgène, ces résultats représentent un modèle particulièrement attractif pour la transformation du blé ou d’autres céréales.
Partenaires
Ce travail fait l’objet d’une thèse de doctorat, promoteur Professeur P. du Jardin, Faculté universitaire des Sciences agronomiques, Gembloux. Des études nécessitant la technique d’analyse d’images sont réalisées par Ir. O. Mostade, Centre wallon de Recherches agronomiques. Les études histologiques sont effectuées avec l’aide du Professeur J. Bouharmont, UCL. Ir. V. Planchon and Dr. R. Oger, Centre wallon de Recherches agronomiques, contribuent aux analyses statistiques.
