Méthodes de screening et d’identification pour le contrôle officiel des antibiotiques et des promoteurs de croissance prohibés en alimentation animale

Contexte

Le projet SIMBAG-FEED a été proposé dans le cadre du Topic II.15 des appels dédiés au développement 10/99. Il répond au programme spécifique « Croissance concurrentielle et soutenable ». Dans ce programme, il est lié à l’action générique « Mesure et contrôle ». Le projet est intitulé « Méthodes de screening et d’identification pour le contrôle officiel de la présence d’antibiotiques et de promoteurs de croissance prohibés en alimentation animale ».

Après les dernières crises qui ont secoué le secteur de l’alimentation, tant animale qu’humaine, il est impératif de rendre confiance aux consommateurs pour ce qui touche la qualité des produits alimentaires européens.

Dans le but de préserver la santé humaine, l’utilisation en alimentation animale de certains antibiotiques et de certains promoteurs de croissance a été interdite par la commission européenne en 1999. Les antibiotiques ont été interdits parce qu’ils sont susceptibles d’induire une résistance bactérienne. Les promoteurs de croissance l’ont été à cause de leur toxicité.

Des méthodes analytiques efficaces et officialisées permettent une application aisée des directives et des décisions officielles en matières de contrôle.

Objectifs

L’objectif principal du projet SIMBAG-FEED est de développer, d’améliorer et de valider des méthodes multi-résidus pour la détection et la détermination des antibiotiques et des promoteurs de croissance prohibés en alimentation animale.

Le second objectif est la mise en place d’une banque de standards de référence pour ces produits, destinés aux laboratoires officiels de contrôle dans les Etats de l’Union européenne.
Les antibiotiques prohibés étudiés dans ce projet sont l’avoparcine, la bacitracine-zin, la spiramycine, la virginiamycine et la tylosine. Deux promoteurs de croissance sont aussi recherchés, le carbadox et l’olaquindox.

Description des tâches

Afin de développer une stratégie de contrôle des produits prohibés, une procédure multimodale basée sur les techniques suivantes a été étudiée :
- inhibition microbiologique,
- électrophorèse à haut-voltage et chromatographie sur couche mince,
- chromatographie liquide haute performance,
- chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à la spectrométrie de masse (SM).

Le projet est organisé en 8 groupes de travail. Cinq groupes se focalisent sur le développement, l’amélioration de 5 techniques d’analyse. Les 5 méthodes vont être validées une première fois par des études inter-laboratoires gérées par le 6ème groupe de travail. Les 2 derniers groupes s’occupent de la validation finale et de la mise sur pied d’une banque de standards de référence.

Le projet est exécuté suivant une stratégie qui varie selon les produits. Pour la détection des antibiotiques, 3 étapes sont proposées : un screening, un post screening et une confirmation de résultats. Pour le cas des promoteurs de croissance, 2 étapes sont proposées : un screening et une confirmation.

Pour les analyses d’antibiotiques prohibés, les méthodes suivantes sont utilisées :
- la technique d’inhibition microbiologique pour le screening,
- l’électrophorèse et la chromatographie sur couche mince pour le post sreening,
- la CLHP couplée à la SM pour la confirmation des résultats.

La stratégie utilisée dans le cas des accélérateurs de croissance est :
- la CLHP (détecteur U.V.) pour le screening
- la CLHP combinée à un détecteur à barrette de diodes ou à la SM pour la confirmation des résultats.

Le projet SIMBAG-FEED collabore avec un autre projet : Feedstuffs-RADIUS (Détection rapide d’antibiotiques illégaux et non autorisés en alimentation animale), contrat n° QLK5-CT-2000-00900). La collaboration entre les deux projets s’articule sur l’utilisation de la CLHP couplée à la SM pour déterminer l’identité et la concentration des substances décelées.

Résultats attendus

Sur le plan analytique, les limites de détection pour chaque produit doivent être au moins 5 fois inférieures à la valeur autorisée par la directive 70/524/CEE. Par conséquent, la limite de détection de chaque antibiotique doit être au moins égale à 1 ppm (mg/kg). Dans le cas des promoteurs de croissance, les limites de détection doivent être au moins égales à 3 ppm pour l’olaquindox et 4 ppm pour le carbadox.
A la fin du projet, un nombre suffisant de standards de référence doit être prêt et stocké enfin d’approvisionner les laboratoires officiels de contrôles de l’Union européenne sur une période d’au moins 10 ans.

Contribution

Le CRA-W a été choisi comme partenaire pour son expérience dans le domaine des antibiotiques (détection et détermination dans diverses matrices). Il a apporté sa contribution en participant, à des réunions de travail et à une étude inter-laboratoire sur le dosage des accélérateurs de croissance dans les aliments pour animaux.

1. Participation à des réunions de travail
Une session plénière a été organisée à Rome (Italie) le 21 juin 2004. Au cours de la réunion, les progrès sur le développement des méthodes à l’échelle intra-laboratoire ont été discutés en détails.

Le CRA-W a participé à la réunion qui s’est tenue à Rennes (France), les 19, 20 et 21 mai 2003. Les discussions ont porté sur l’état d’avancement des méthodes et la préparation des essais de validation inter-laboratoires.

Le CRA-W était parmi les participants à la séance de travail de Lisbonne (Portugal) du 4 au 6 février 2004. Les discussions ont porté sur les progrès réalisés dans la mise au point des méthodes d’analyse et sur la réalisation des essais de validation inter-laboratoires.

2. Collaboration scientifique sur la méthode HPLC pour le dosage des accélérateurs de croissance
Le CRA-W a participé à l’étude préliminaire : «Détermination simultanée des teneurs en carbadox et en olaquindox par méthode CLHP».

Les principaux résultats obtenus par le CRA-W au cours de cette étude sont :
- la méthode a été reproduite au laboratoire. Pour le dosage du carbadox, le CRA-W a détecté des interférences dues à la matrice.
- Les limites de détection obtenues montre que la méthode est suffisamment sensible pour le dosage des deux facteurs de croissance.
- Dans la stratégie de contrôle des facteurs de croissance, le CRA-W recommande l’utilisation du détecteur UV pour un premier criblage. Pour les échantillons positifs, il convient d’utiliser un détecteur à barrette de diodes pour confirmer les résultats. L’identification et la pureté des standards et des produits, peuvent être contrôlées par combinaison des techniques CLHP et SM.

Partenaires

Le projet SIMBAG-FEED réunit 10 partenaires comprenant des laboratoires officiels, des centres de recherche et des universités, originaires de 8 pays européens impliqués dans le contrôle de l’alimentation animale. Le projet est sous la coordination de l’institut de la sécurité alimentaire de Wageningen en Hollande (RIKILT).

Dans ce projet, le CRA-W participe spécialement dans le groupe de travail qui s’occupe de la mise au point d’une méthode CLHP pour le dosage du carbadox et de l’olaquindox. Dans ce domaine, les principaux partenaires sont:
- Gianfranco Brambilla, ISS, Rome, Italie,
- Christophe Genouel, DGCCRF, Rennes, France,
- Erik Nordkvist, SVA, Uppsala, Suède.