Développement d’une méthode quantitative pour la détection des transgènes applicable en routine aux productions agricoles et aux denrées alimentaires

Contexte

Le 22 juillet 2003, le conseil des Ministres a formellement adopté deux propositions de la Commission européenne relatives aux organismes génétiquement modifiés, réglementant la mise sur le marché et l’étiquetage des denrées alimentaires et aliments pour animaux obtenus à partir d’OGM. Déjà obligatoire pour les produits contenant plus de 1% d’OGM ou de dérivés d’OGM, l’étiquetage devient nécessaire si l’aliment contient plus de 0,9 % d’OGM. L’étiquetage a également été rendu obligatoire pour des aliments qui n’étaient auparavant pas concernés tels les huiles de soja et de maïs hautement raffinées (c'est l'origine génétique qui importe). Le 23 juillet 2003, la Commission a publié des recommandations (2003/556/CE) visant à assurer la coexistence des cultures génétiquement modifiées et des autres cultures. Ces deux règlements complètent la directive 2001/18 sur la dissémination volontaire des OGM dans l’environnement et annoncent la levée du moratoire concernant les demandes d’introduction de nouvelles lignées transgéniques sur le marché européen. Les règlements 1829/2003/CE, 1830/2003/CE et 641/2004/CE quant à eux ont instauré un système communautaire harmonisé de traçabilité des OGM, introduit l’étiquetage obligatoire des aliments pour animaux génétiquement modifiés et renforcé les règles relatives à l’étiquetage des denrées alimentaires génétiquement modifiées. Il est donc impératif de posséder de nouveaux outils qui permettent de détecter les espèces végétales dans un mélange et les OGM qui pourraient y être associés et de quantifier les teneurs en OGM. De plus, les outils doivent pouvoir analyser rapidement un grand nombre de possibilités et leurs limites sur des produits hautement transformés.

Objectifs

Le premier objectif de ce projet consiste en la mise au point d’une méthode de screening pour la détection d’espèces végétales. Pour contribuer à une identification efficace des transgènes, il est en effet capital de pouvoir déterminer quelles sont les espèces végétales présentes dans l’échantillon agro-alimentaire à analyser. Ce screening a été abordé par la technique de PCR en temps réel et par la technique des biochips. Le second objectif porte sur l'évaluation de différentes approches de quantification des OGM ou de leurs dérivés sur biochips. L’intérêt d’une telle biochips quantitative est qu’elle devrait permettre un screening quantitatif par rapport à une valeur seuil (par exemple 0,9%). A titre illustratif, tout échantillon que la biochips quantifierait en-dessous d’une teneur de 0,7% pour un OGM donné serait à considérer comme certainement en-dessous du seuil de 0,9% et vice-versa dès qu’une valeur de 1,1% serait dépassée, on serait assuré que l’on est sans conteste au-dessus de 0,9%. Demeure alors la plage allant de 0,7 à 1,1%, pour laquelle une nouvelle mesure mais cette fois par PCR en temps réel est requise pour vérifier plus précisément où l’on se situe par rapport à la valeur seuil de 0,9%. La PCR en temps réel demeure en effet toujours plus précise du fait qu’elle ne se fonde pas sur une détection en point final. Cependant, les biochips gardent l’avantage manifeste de pouvoir effectuer une quantité appréciable d’analyses avec un nombre limité de PCR. Ce caractère serait encore renforcé dans le cadre d’une biochips quantitative.

Résultats obtenus

En ce qui concerne la détection des espèces végétales, les premières cibles utilisées visent des séquences de l’ADN chloroplastique (rbcL), de la sucrose synthase et de la rubisco activase. Les séquences de ces cibles présentent des séquences homologues, sur lesquelles des amorces "universelles" ont pu être sélectionnées, qui entourent des régions plus variables utilisées pour effectuer la distinction des espèces par l'emploi de sondes de capture (biochips) ou de sondes d'hybridation (PCR en temps réel). D'après les résultats de PCR en temps réel, il ressort que les cibles rbcL (multicopies) sont plus sensibles que les cibles sucrose synthase ou rubisco activase. L'approche par biochips n'ayant pu aboutir a une spécificité suffisante envers les diverses espèces végétales avec un seul type de cible, des damiers rassemblant plusieurs types de cibles ont été construits. Ces damiers permettent de donner des informations sur la composition de différents types de matrices agroalimentaires. De nouvelles cibles visant des gènes ou portions de gènes spécifiques aux espèces végétales considérées ont été mises au point ( lin, pomme de terre, chicorée) ou recherchées dans la littérature (blé, coton, tournesol, riz, tomate). Leur spécificité et applicabilité a pu être montrée par PCR en temps réel. Dans la seconde partie du projet visant à explorer les possibilités de quantification des OGM sur biochips, la technique a consisté à relier les rapports d'intensité des spots des cibles spécifiques et transgéniques d'une série de standards à la teneur en OGM afin d'établir une courbe de calibration. Trois approches différentes ont été envisagées. - La première envisage la quantification sur base de farines de référence comme standards. Cette technique a permis d'établir une courbe de calibration pour les faibles concentrations en OGM. Pour des teneurs en transgènes plus élevées, la technique se heurte à un problème de saturation des spots et de contrôle de la compétitivité entre cibles. - La seconde technique a nécessité la mise au point de standards plasmidiques d'un nouveau type qui ont été construits au CRA-W. Ces standards possèdent deux inserts (relatifs aux cibles spécifiques et transgéniques) dont la séquence interne a été modifiée de manière à ce que les différents plasmides puissent être distingués séparément par des sondes d'hybridations ou des sondes de capture. La PCR en temps réel a montré que ces différents standards ne peuvent être amplifiés ensemble à différentes concentrations car un phénomène de compétition se produit et les cibles présentes en de plus faibles concentrations ne sont plus détectées. En revanche, la quantification par PCR en temps réel fonctionne avec ce type de standards lorsqu'ils sont considérés séparément. Il n'en va pas de même sur biochips car il apparaît que les sondes de capture des différents calibrateurs ont des efficacités sensiblement différentes malgré leur homologie de taille, de pourcentage en GC et de Tm. - La troisième technique repose sur une PCR compétitive qui requiert la mise au point et l’utilisation d’amorces particulières appelées "bipartites". Celles-ci sont ainsi dénommées car une partie de leur séquence s’hybride de manière spécifique sur le segment d’ADN à amplifier, alors qu’une autre partie ‘universelle’, toujours constante, est elle-même spécifique à une autre amorce, l’amorce ‘universelle’, ou ‘Head’. Après résolution de divers problèmes techniques, la technique a permis d'établir des courbes de calibration pour le soja Roundup Ready. La méthode a également été transposée pour la quantification des maïs Bt11 et MON810. La participation à une étude de pré-validation de la biochips de criblage OGM a également été effectuée au cours du projet. Celle-ci a montré l'applicabilité de la biochips pour la détection des OGM. Des tests effectués sur un certains nombre de matrices agroalimentaires ont montré que ces biochips pouvaient être utilisables sur des échantillons rencontrés dans les analyses de routine.

Partenaires

Ce projet est le fruit d’une collaboration entre les FUNDP (Unité de Biologie et Biochimie Cellulaire, Namur) et le Département Valorisation des Productions agricoles (Unité Authentification et traçabilité) du CRA-W de Gembloux (région wallonne).